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如何选择高质量ELISA试剂盒

2022-06-20
297次

酶联免疫吸附法(ELISA)是指将可溶性的抗原或抗体吸附到聚苯乙烯等固相载体上,进行免疫反应从而对液体生物标本中微量物质进行测定的定性和定量方法。

检测原理

1、使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。

2、使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入反应底物后,底物被酶催化转化为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

ELISA检测具有灵敏度高、特异性强、操作简单、样本量少等特色,且检测结果准确度高,重复性好,在临床及科研的抗原抗体检测及病原体检测方面得到了广泛的使用。目前市面上ELISA试剂盒品牌驳杂,检测指标种类、别名繁多,产品质量参差不齐,我们应该怎么挑选适用的ELISA试剂盒产品呢?有哪些指标是需要我们考虑的呢?

首先,客户需要明确实验目的是做靶标功能性测定还是含量检测。功能性测定一般是酶及底物的反应,对生物活性的分析。而Elisa专用于靶标分子的含量检测。

其次,如果所研究指标为蛋白质或多肽,可以到Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)查询对应的的Uniprot ID,在选择产品时同时核对指标名和Uniprot ID;如果所研究指标为小分子半抗原,此类化学物质可以到ChemSpider化学品库(http://www.chemspider.com)查询对应的CAS号,结合CAS号选择需要的产品。

  然后,我们还需要根据已有文献查询或预判靶标在生物样本中的有无或含量区间,针对性选择灵敏度足够的试剂盒,同时和厂商确认试剂盒的适用样本是否包含客户自己的实验样本。

  在此基础上,如果客户有多种品牌的同类产品可以选择,还应比较试剂盒产品的多项性能参数,包括灵敏度、特异性、精密性、准确度、线性、稳定性、天然样本数据。这些参数是ELISA作为一种人为建立的微量分析方法为确保其有效性和可信度所必须考量的内在固有的特性。

1、灵敏度(sensitivity)试剂盒对于被检物质的最低检测能力,如果我们待检物质浓度量很低,可以选择高灵敏的试剂盒。灵敏度取值为空白对照的标准差对应的浓度值的3倍。

FineTest拥有独特的信号放大专利技术,能灵活调整试剂盒的灵敏度,最高可将灵敏度提高到fg级别,并有能力提高客户样品检出率。

2、特异性(Specificity)判断其他分子与试剂盒抗体的结合能力。交叉反应越小,试剂盒的特异性越好。一般需要衡量试剂盒与当前种属同家族蛋白和其它种属该蛋白、血清中常见因子(如异嗜性抗体、类风湿性因子等)、靶蛋白互作蛋白无交叉反应。为保证试剂盒特异性,FineTest主要有这3方面的努力:

2.1、从原料上精选单克隆抗体和多克隆抗体对;

2.2、从反应溶液体系上优化包被缓冲液、样本稀释液和抗体稀释液来抵抗基质效应;

2.3、从测定物本身特性优化,天然抗原和重组蛋白抗原与捕获抗体结合力的强弱由于结合后蛋白构象的改变而不同进而会影响检测值的区别。

3、精密性(Precision)也叫重复性,是对同一样品重复测定时误差大小的评估参数。一般要求板间及板内精密性控制在10%以内。

FineTest使用全机器生产,排除人工的不稳定性,依靠电子移液枪和自动包板机精确加样,严格控制批内差批间差。

4、准确度(Recovery ) 一般通过加标(spike-in)回收率来衡量,回收率在80%-120%之间为合格。通过添加标准品到天然样本机制内进行测定,以不添加标准品的天然样本基质为空白对照,回收率数值为靶标的测定浓度与添加的标准品浓度比值,以百分比计。回收率偏高或偏低会产生假阳性或假阴性结果,影响测定值的准确性。

Matix

Recovery Range (%)

Average (%)

Serum(n=5)

85-98

93

EDTA Plasma(n=5)

88-100

95

Heparin Plasma(n=5)

86-98

93

5、线性度(Linearity ) 在天然样本基质中添加有适当浓度的标准品,分别稀释2倍、4倍、8倍来检测,测定各浓度下的回收率,回收率在80%-120%之间为合格。

Sample

1:2

1:4

1:8

Serum(n=5)

82-98%

84-100%

82-100%

EDTA Plasma(n=5)

80-104%

90-102%

86-97%

Heparin Plasma(n=5)

82-95%

83-98%

84-100%

6、稳定性(Stability ) 一般以加速破坏性实验进行验证,将未拆封的试剂盒在37℃2-8℃分别放置一定时间,考察各项性能指标的偏差,以偏差小于10%为合格。稳定性越好,试剂盒存储时间越长。

FineTest自主开发的稳定系统可以让试剂盒在40度的环境下存放一周,活性不低于95%。大部分试剂盒可以在4度存放两年活性依然能保持85-95%。基本不影响试剂盒工作和结果的准确性。

7、天然样本检测

  最后,还应明确试剂盒可以检测天然样本及合适的样本类型。根据靶点性质预判适合检测的样本,并实际检测该类样本数量达到5例以上,在客户需要时提供一定的样本含量数据参考。在市场上,根据国内外各大科研院所科研人员和行业内广大厂家的共识,ELISA试剂盒通常被分为低端、中端和高端三类,一般也是用这七项性能参数来区分的。优秀的ELISA试剂盒产品将极大地促进我们实验进度,帮助我们拿到珍贵可靠的实验数据。


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