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FC实验操作流程

2022-06-20
333次

FC实验步骤

一、细胞表面染色操作流程

1、细胞计数:将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数;500g离心4min,去上清;

2、制备单细胞悬液:将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬,400g离心3min,去上清,重复2次;用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x106个细胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl细胞悬液;

3、(可选)阻断Fc受体:室温孵育10-20min;

4、一抗孵育:每孔加入稀释后的一抗溶液100μl,2-8℃反应30min;

5、洗涤:400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍;

6、二抗孵育:对于非荧光染料直标抗体,加入100μl荧光二抗重悬,避光2-8℃反应30min。对于直标抗体直接跳到步骤8;

7、洗涤:400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍;

8、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞,4℃保存,上机分析。

二、细胞胞内染色操作流程

1、细胞计数:将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数;500g离心4min,去上清;

2、制备单细胞悬液:将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬,400g离心3min,去上清,重复2次;用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x106个细胞/mL,分配到96孔板中,每孔100μl细胞悬液,400g离心5min去上清;

3、固定:每孔加入100μl细胞固定剂重悬细胞,2-8°孵育20min;

4、洗涤:400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍;

5、通透:每孔加入100μl细胞通透剂重悬细胞,室温孵育20min;

6、洗涤:400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍;

7、(可选)阻断Fc受体:10-20min;

8、一抗孵育:每孔加入稀释后的一抗溶液100μl,2-8℃反应30min;

9、洗涤:400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍;

10、二抗孵育:对于非荧光染料直标抗体,加入100μl荧光二抗重悬,避光2-8℃反应30min。对于直标抗体直接跳到步骤11;

11、洗涤:400g离心5min,去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬,离心去上清,重复两遍;

12、用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞,4℃保存,上机分析。


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